BIOTEKNOLOGI KONVENSIONAL

 Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa.

• Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya.
• Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa.
• Bioteknologi secara sederhana sudah dikenal oleh manusia sejak ribuan tahun yang lalu. Sebagai contoh, di bidang teknologi pangan adalah pembuatan bir, roti, maupun keju yang sudah dikenal sejak abad ke-19, pemuliaan tanaman untuk menghasilkan varietas-varietas baru di bidang pertanian, serta pemuliaan dan reproduksi hewan.
• Di bidang medis, penerapan bioteknologi di masa lalu dibuktikan antara lain dengan penemuan vaksin, antibiotik, dan insulin walaupun masih dalam jumlah yang terbatas akibat proses fermentasi yang tidak sempurna.
• Perubahan signifikan terjadi setelah penemuan bioreaktor oleh Louis Pasteur.
• Dengan alat ini, produksi antibiotik maupun vaksin dapat dilakukan secara massal.
• Pada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju.
• Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, rekombinan DNA, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain.
• Teknologi ini memungkinkan kita untuk memperoleh penyembuhan penyakit-penyakit genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan, seperti kanker ataupun AIDS.
• Penelitian di bidang pengembangan sel induk juga memungkinkan para penderita stroke ataupun penyakit lain yang mengakibatkan kehilangan atau kerusakan pada jaringan tubuh dapat sembuh seperti sediakala.

• Di bidang pangan, dengan menggunakan teknologi rekayasa genetika, kultur jaringan dan rekombinan DNA, dapat dihasilkan tanaman dengan sifat dan produk unggul karena mengandung zat gizi yang lebih jika dibandingkan tanaman biasa, serta juga lebih tahan terhadap hama maupun tekanan lingkungan.
• Penerapan bioteknologi di masa ini juga dapat dijumpai pada pelestarian lingkungan hidup dari polusi. Sebagai contoh, pada penguraian minyak bumi yang tertumpah ke laut oleh bakteri, dan penguraian zat-zat yang bersifat toksik (racun) di sungai atau laut dengan menggunakan bakteri jenis baru.
• Kemajuan di bidang bioteknologi tak lepas dari berbagai kontroversi yang melingkupi perkembangan teknologinya. Sebagai contoh, teknologi kloning dan rekayasa genetika terhadap tanaman pangan mendapat kecaman dari bermacam-macam golongan.

Bioteknologi dapat digolongkan menjadi bioteknologi konvensional/tradisionaldan modern.

BIOLOGI KONVENSIONAL/ TRADISIONAL

• bioteknologi yang memanfaatkan mikroorganisme untuk memproduksi alkohol, asam asetat, gula, atau bahan makanan, seperti tempe, tape, oncom, dan kecap.
• Mikroorganisme dapat mengubah bahan pangan.
• Proses yang dibantu mikroorganisme, misalnya dengan fermentasi, hasilnya antara lain tempe, tape, kecap, dan sebagainya termasuk keju dan yoghurt. Proses tersebut dianggap sebagai bioteknologi masa lalu.
• Ciri khas yang tampak pada bioteknologi konvensional, yaitu adanya penggunaan makhluk hidup secara langsung dan belum tahu adanya penggunaan enzim

Pengolahan Bahan Makanan

Pengolahan produk susu

• Susu dapat diolah menjadi bentuk-bentuk baru, seperti yoghurt, keju, dan mentega.

Yoghurt

• Untuk membuat yoghurt, susu dipasteurisasi terlebih dahulu, selanjutnya sebagian besar lemak dibuang.
• Mikroorganisme yang berperan dalam pembuatan yoghurt, yaitu Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus.
• Kedua bakteri tersebut ditambahkan pada susu dengan jumlah yang seimbang, selanjutnya disimpan selama ± 5 jam pada temperatur 45oC.
• Selama penyimpanan tersebut pH akan turun menjadi 4,0 sebagai akibat dari kegiatan bakteri asam laktat.
• Selanjutnya susu didinginkan dan dapat diberi cita rasa. Jadi deh Yoghurt

Keju

• Dalam pembuatan keju digunakan bakteri asam laktat, yaitu Lactobacillus dan Streptococcus.
• Bakteri tersebut berfungsi memfermentasikan laktosa dalam susu menjadi asam laktat.
• Proses pembuatan keju diawali dengan pemanasan susu dengan suhu 90 derajad C atau dipasteurisasi, kemudian didinginkan sampai 30 derajad C.
• Selanjutnya bakteri asam laktat dicampurkan.
• Akibat dari kegiatan bakteri tersebut pH menurun dan susu terpisah menjadi cairan whey dan dadih padat,
• kemudian ditambahkan enzim renin dari lambung sapi muda untuk mengumpulkan dadih.
• Enzim renin dewasa ini telah digantikan dengan enzim buatan, yaitu klimosin.
• Dadih yang terbentuk selanjutnya dipanaskan pada temperatur 32oC – 420oC dan ditambah garam, kemudian ditekan untuk membuang air dan disimpan agar matang. Adapun whey yang terbentuk diperas lalu digunakan untuk makanan sapi. OK

Mentega

• Pembuatan mentega menggunakan mikroorganisme Streptococcus lactis dan Lectonosto ceremoris.
• Bakteri-bakteri tersebut membentuk proses pengasaman.
• Selanjutnya, susu diberi cita rasa tertentu dan lemak mentega dipisahkan.
• Kemudian lemak mentega diaduk untuk menghasilkan mentega yang siap dimakan.

Produk makanan nonsusu

Kecap

• Dalam pembuatan kecap, jamur, Aspergillus wentii dibiakkan pada kulit gandum terlebih dahulu.
• Jamur Aspergillus wentii bersama-sama dengan bakteri asam laktat yang tumbuh pada kedelai yang telah dimasak menghancurkan campuran gandum.
• Setelah proses fermentasi karbohidrat berlangsung cukup lama akhirnya akan dihasilkan produk kecap.

Pembuatan Kecap

• Pembuatan kecap dengan cara fermentasi di Indonesia, secara singkat adalah sebagai berikut:

1. kedelai dibersihkan dan direndam dalam air pada suhu kamar selama 12 jam, kemudian direbus selama 4-5 jam sampai lunak.
2. Setelah direbus, kedelai ditiriskan dan didinginkan di atas tampah.
3. Tampah tersebut ditutup dengan lembaran karung goni, karung terigu, atau lembaran plastik. Karena terus berulang kali dipakai, bahan yang digunakan sebagai penutup ini biasanya mengandung spora, sehingga berfungsi sebagai inokulum.
4. Spora kapang Aspergillus wentii akan bergerminasi dan tumbuh pada substrat kedelai dalam waktu 3 sampai 12 hari pada suhu kamar.
5. Kapang dan miselium yang terbentuk akibat fermentasi inilah yang dinamakan koji.
6. Selanjutnya, koji diremas-remas, dijemur, dan kulitnya dibuang.
7. Koji dimasukkan ke dalam wadah dari tanah, tong kayu, atau tong plastik yang berisi larutan garam 20-30 persen.
8. Campuran antara kedelai yang telah mengalami fermentasi kapang (koji) dengan larutan garam inilah yang dinamakan moromi.
9. Fermentasi moromi dilanjutkan selama 14-120 hari pada suhu kamar.
10. Setelah itu, cairan moromi dimasak dan kemudian disaring.

• Untuk membuat kecap manis, ke dalam filtrat ditambahkan gula merah dan bumbu-bumbu lainnya, diaduk sampai rata dan dimasak selama 4-5 jam.
• Untuk membuat kecap asin, sedikit gula merah ditambahkan ke dalam filtrat, diaduk, dan dimasak selama 1 jam.
• Kecap yang telah masak, selanjutnya disaring dengan alat separator untuk memisahkan kecap dari berbagai kotoran, kemudian didinginkan.
• Langkah akhir pembuatan kecap adalah memasukkannya ke dalam botol gelas, botol plastik, atau botol pet. Beres Deh OK

• Secara tradisional, kecap dibuat dengan proses fermentasi, yaitu menggunakan jasa mikroorganisme kapang, khamir, dan bakteri untuk mengubah senyawa makromolekul kompleks yang ada dalam kedelai (seperti protein, lemak, dan karbohidrat) menjadi senyawa yang lebih sederhana, seperti peptida, asam amino, asam lemak dan monosakarida.
• Adanya proses fermentasi tersebut menjadikan zat-zat gizi dalam kecap menjadi lebih mudah dicerna, diserap, dan dimanfaatkan oleh tubuh.

Tempe

• Tempe kadang-kadang dianggap sebagai bahan makanan masyarakat golongan menengah ke bawah, sehingga masyarakat merasa gengsi memasukkan tempe sebgai salah satu menu makanannya.
• Akan tetapi, setelah diketahui manfaatnya bagi kesehatan, tempe mulai banyak dicari dan digemari masyarakat dalam maupun luar negeri.
• Jenis tempe sebenarnya sangat beragam, bergantung pada bahan dasarnya, namun yang paling luas penyebarannya adalah tempe kedelai.
• Tempe mempunyai nilai gizi yang baik.
• Di samping itu tempe mempunyai beberapa khasiat seperti

1. dapat mencegah dan mengendalikan diare
2. mempercepat proses penyembuhan duodenitis
3. memperlancar pencernaan
4. dapat menurunkan kadar kolesterol,
5. dapat mengurangi toksisitas
6. meningkatkan vitalitas
7. mencegah anemia
8. menghambat ketuaan
9. serta mampu menghambat resiko jantung koroner, penyakit gula, dan kanker.

• Untuk membuat tempe, selain diperlukan bahan dasar kedelai juga diperlukan ragi.
• Ragi merupakan kumpulan spora mikroorganisme, dalam hal ini kapang.
• Dalam proses pembuatan tempe paling sedikit diperlukan empat jenis kapang dari genus Rhizopus

1. Rhyzopus oligosporus
2. Rhyzopus stolonifer
3. Rhyzopus arrhizus
4. Rhyzopus oryzae.

• Miselium dari kapang tersebut akan mengikat keping-keping biji kedelai dan memfermentasikannya menjadi produk tempe.
• Proses fermentasi tersebut menyebabkan terjadinya perubahan kimia pada protein, lemak, dan karbohidrat.
• Perubahan tersebut meningkatkan kadar protein tempe sampai sembilan kali lipat.

Tape

• Tape dibuat dari bahan dasar ketela pohon dengan menggunakan sel-sel ragi dari spora Aspergillus oryzae
• Ragi menghasilkan enzim yang dapat mengubah zat tepung menjadi produk yang berupa gula dan alkohol.
• Masyarakat kita membuat tape tersebut berdasarkan pengalaman.

BIOTEKNOLOGI MODERN

• Seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan, para ahli telah mulai lagi mengembangkan bioteknologi dengan memanfaatkan prinsip-prinsip ilmiah melalui penelitian.
• Dalam bioteknologi modern orang berupaya dapat menghasilkan produk secara efektif dan efisien.
• Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA, selain memanfaatkan dasar mikrobiologi dan biokimia.
• Aplikasi bioteknologi modern juga mencakup berbagai aspek kehidupan manusia, misalnya pada aspek pangan, pertanian, peternakan, hingga kesehatan dan pengobatan.
• Dewasa ini, bioteknologi tidak hanya dimanfaatkan dalam industri makanan tetapi telah mencakup berbagai bidang, seperti rekayasa genetika, penanganan polusi, penciptaan sumber energi, dan sebagainya.
• Dengan adanya berbagai penelitian serta perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, maka bioteknologi makin besar manfaatnya untuk masa-masa yang akan datang.
• Beberapa penerapan bioteknologi modern sebagai berikut.

REKAYASA GENETIKA

• Rekayasa genetika merupakan suatu cara memanipulasikan gen untuk menghasilkan makhluk hidup baru dengan sifat yang diinginkan.
• Rekayasa genetika disebut juga pencangkokan gen atau rekombinasi DNA.
• Dalam rekayasa genetika digunakan DNA untuk menggabungkan sifat makhluk hidup.
• Hal itu karena DNA dari setiap makhluk hidup mempunyai struktur yang sama, sehingga dapat direkomendasikan.
• Selanjutnya DNA tersebut akan mengatur sifatsifat makhluk hidup secara turun-temurun.
• Untuk mengubah DNA sel dapat dilakukan melalui banyak cara, misalnya melalui transplantasi inti, fusi sel, teknologi plasmid, dan rekombinasi DNA.

Transplantasi inti

• Transplantasi inti adalah pemindahan inti dari suatu sel ke sel yang lain agar didapatkan individu baru dengan sifat sesuai dengan inti yang diterimanya.
• Transplantasi inti pernah dilakukan terhadap sel katak.
• Inti sel yang dipindahkan adalah inti dari sel-sel usus katak yang bersifat diploid.
• Inti sel tersebut dimasukkan ke dalam ovum tanpa inti, sehingga terbentuk ovum dengan inti diploid.
• Setelah diberi inti baru, ovum membelah secara mitosis berkali-kali sehingga terbentuklah morula yang berkembang menjadi blastula.
• Blastula tersebut selanjutnya dipotong-potong menjadi banyak sel dan diambil intinya.
• Kemudian inti-inti tersebut dimasukkan ke dalam ovum tanpa inti yang lain.
• Pada akhirnya terbentuk ovum berinti diploid dalam jumlah banyak.
• Masing-masing ovum akan berkembang menjadi individu baru dengan sifat dan jenis kelamin yang sama.

Fusi sel/Hibridoma

• Fusi sel adalah peleburan dua sel baik dari spesies yang sama maupun berbeda supaya terbentuk sel bastar atau hibridoma.
• Fusi sel diawali oleh pelebaran membran dua sel serta diikuti oleh peleburan sitoplasma (plasmogami) dan peleburan inti sel (kariogami).
• Manfaat fusi sel, antara lain untuk pemetaan kromosom, membuat antibodi monoklonal, dan membentuk spesies baru.
• Di dalam fusi sel diperlukan adanya:

1. sel sumber gen (sumber sifat ideal)
2. sel wadah (sel yang mampu membelah cepat)
3. fusigen (zat-zat yang mempercepat fusi sel).

Teknologi plasmid

• Plasmid adalah lingkaran DNA kecil yang terdapat di dalam sel bakteri atau ragi di luar kromosomnya.
• Sifat-sifat plasmid, antara lain:

1. merupakan molekul DNA yang mengandung gen tertentu
2. dapat beraplikasi diri
3. dapat berpindah ke sel bakteri lain
4. sifat plasmid pada keturunan bakteri sama dengan plasmid induk.

• Karena sifat-sifat tersebut di atas plasmid digunakan sebagai vektor atau pemindah gen ke dalam sel target.

Rekombinasi DNA

• Rekombinasi DNA adalah proses penggabungan DNA-DNA dari sumber yang berbeda. Tujuannya adalah untuk menyambungkan gen yang ada di dalamnya.
• Oleh karena itu, rekombinasi DNA disebut juga rekombinasi gen.
• Rekombinasi DNA dapat dilakukan karena alasan-alasan sebagai berikut.

1. Struktur DNA setiap spesies makhluk hidup sama
2. DNA dapat disambungkan

Bioteknologi bidang kedokteran

• Bioteknologi mempunyai peran penting dalam bidang kedokteran, misalnya dalam pembuatan antibodi monoklonal, vaksin, antibiotika dan hormon.

Pembuatan antibodi monoklonal

• Antibodi monoklonal adalah antibodi yang diperoleh dari suatu sumber tunggal.
• Manfaat antibodi monoklonal, antara lain:

1. untuk mendeteksi kandungan hormon korionik gonadotropin dalam urine wanita hamil
2. mengikat racun dan menonaktifkannya
3. mencegah penolakan tubuh terhadap hasil transplantasi jaringan lain.

Pembuatan vaksin

• Vaksin digunakan untuk mencegah serangan penyakit terhadap tubuh yang berasal dari mikroorganisme.
• Vaksin didapat dari virus dan bakteri yang telah dilemahkan atau racun yang diambil dari mikroorganisme tersebut.

Pembuatan antibiotika

• Antibiotika adalah suatu zat yang dihasilkan oleh organisme tertentu dan berfungsi untuk menghambat pertumbuhan organisme lain yang ada di sekitarnya.
• Antibiotika dapat diperoleh dari jamur atau bakteri yang diproses dengan cara tertentu.
• Zat antibiotika telah mulai diproduksi secara besar-besaran pada Perang Dunia II oleh para ahli dari Amerika Serikat dan Inggris.

Pembuatan hormon

• Dengan rekayasa DNA, dewasa ini telah digunakan mikroorganisme untuk memproduksi hormon.
• Hormon-hormon yang telah diproduksi, misalnya insulin, hormon pertumbuhan, kortison, dan testosteron.

TANAMAN TRANSGENIC

ROH DASAR KERJA BIOTEKNOLOGI MODERN

• Sebagai metode in vitro, PCR menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA.
• Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh, menyebabkan teknik ini semakin luas digunakan.
• Pada dasarnya, reaksi PCR merupakan tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yakni melalui proses pembukaan rantai DNA utas ganda (denaturasi), penempelan primer (annealing), dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari terminal 5' ke 3'.
• Bedanya dengan replikasi in vivo, teknik ini tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA.
• Secara sederhana, teknik PCR dilakukan dengan mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai ; dan kemudian menaikan dan menurunkan suhu campuran secara berulang dalam beberapa puluh siklus hingga akhirnya diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan.

DETAILNYA DEMIKIAN

A. Prinsip Kerja

• Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik.
• Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik).
• Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides tertentu dapat diperoleh.
• Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening antara primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi.
• Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium.

• PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.
• Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya.
• Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.

• PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo).
• Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida.
• Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’.
• Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan.
• Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.

• PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase.

Kegunaan

• Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:

1. amplifikasi urutan nukleotida.
2. menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.
3. bidang kedokteran forensik.
4. melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.

Waktu yang Dibutuhkan

1. 1-2 hari
2. PCR: 3-6 jam atau semalam
3. Polyacrylamide gel electrophoresis using “Mighty-small II” gel apparatus: 2.5 hours poliakrilamid gel elektroforesis menggunakan “Mighty-small II” bahan gel: 2,5 jam
4. Etidium bromide staining dan fotografi: 45 menit

D. Reagen Khusus

1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi
2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.
4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
5. Minyak mineral ringan
6. Akrilamida (grade elektroforesis)
7. N, N’-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)
8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
9. TEMED (N, N, N’N ‘Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)

E. Peralatan Khusus

1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)
2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)

Komponen PCR lainnya:

1. Enzim DNA Polymerase Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin
2. Primer Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutannukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer.
3. Reagen lainnya Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2. Konsentrasi ion Mg2+dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion Mg2+ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi.

F. Tahapan PCR

1. Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 oC – 95 oC.
2. Penempelan primer Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 oC – 60 oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 oC.
3. Reaksi polimerisasi (extension) Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72 oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.

• Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x.
• Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA.
• Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya.
• Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan.
• Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.

G. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)

• RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA.

• Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3′, maka oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA.

H. Metoda Deteksi Produk PCR

• Produk PCR adalah segmen DNA (amplikon) yang berada dalam jumlah jutaan copy, tetapi tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.
• Oleh karena itu PCR perlu diikuti dengan suatu tahap akhir yang bertujuan untuk memvisualisasikan produk PCR serta sekaligus bertujuan untuk mengetahui ukuran produk PCR dan mengetahui apakah produk yang dihasilkan adalah benar seperti yang diinginkan.
• Salah satu metoda deteksi yang umum dilakukan adalah elektroforesis gen agarosa.